Enzima di restrizione

Enzima di restrizione
L'endonucleasi di restrizione EcoRI (omodimero) si lega al DNA
Identificatore
Nome / i del gene	T2; R.
Classificazione degli enzimi
CE, categoria	3.1.21.4 ,  endonucleasi
Tipo di risposta	idrolisi
Substrato	DNA
Prodotti	due pezzi di DNA
Evento
Taxon genitore	batteri

Gli enzimi di restrizione , più precisamente anche le endonucleasi di restrizione (REN), sono enzimi che riconoscono e tagliano il DNA in determinate posizioni. Le endonucleasi di restrizione si verificano, tra le altre cose, nei batteri e negli archaea , dove servono la difesa contro i batteriofagi . Gli enzimi di restrizione riconoscono il DNA estraneo dal pattern di metilazione mancante o da una sequenza di DNA altrimenti inesistente e quindi idrolizzano il DNA estraneo. Appaiono quindi sempre nel batterio insieme alle tipiche DNA metiltransferasi , che imprimono modelli caratteristici sul DNA batterico.

proprietà

Affinché un batterio abbia enzimi di restrizione come sistema di difesa, sono necessarie almeno tre aree proteiche funzionalmente distinguibili: domini di restrizione, metilazione e riconoscimento della sequenza. Questi tre domini possono essere localizzati su una sola proteina o distribuiti su più.

Ogni endonucleasi di restrizione riconosce una specifica sequenza di basi del DNA. La specificità di un enzima di restrizione in un digest di restrizione dipende , tra le altre cose, dal tampone utilizzato e dai cofattori .

Gli enzimi di restrizione sono utilizzati in biochimica per tagliare il DNA in posizioni definite, ad es. B. in un'analisi di restrizione (una digestione di restrizione con successiva elettroforesi su gel di agarosio ) o una clonazione . Quindi questi enzimi sono noti anche come forbici molecolari . Per unire le estremità tagliate in modo covalente , viene utilizzata una ligasi (nel caso delle estremità appiccicose solo dopo l' ibridazione ) . In caso di condizioni ambientali errate, possono essere applicate anche restrizioni non specifiche, che sono note come attività stellari . La specificità delle endonucleasi di restrizione può essere adattata in modo specifico a una sequenza di DNA desiderata mediante un disegno proteico , ad es. B. nelle nucleasi a dito di zinco .

Le posizioni delle interfacce dei singoli enzimi di restrizione possono essere mostrate nelle mappe di restrizione di un DNA. Tali mappe sono disponibili per genomi e plasmidi , ad esempio . Utilizzando la lunghezza dei frammenti di DNA che si formano quando il DNA viene tagliato dagli enzimi di restrizione, le sezioni di DNA possono essere identificate rispetto a una mappa di restrizione.

Classificazione

In base alle loro proprietà, viene fatta una distinzione tra quattro tipi principali, che sono ulteriormente suddivisi in diversi sottotipi:

• Il tipo I taglia il DNA in una posizione casuale lontana dalla sequenza di riconoscimento. Richiede ATP e trasferisce un gruppo metile dalla S-adenosil metionina.
• Il tipo II taglia il DNA all'interno o in prossimità della sequenza di riconoscimento. Non richiede ATP e non ha attività metiltransferasica.
• Il tipo III taglia il DNA da circa 20 a 25 coppie di basi dalla sequenza di riconoscimento. Richiede ATP e trasferisce un gruppo metile dalla S-adenosil metionina.
• Il tipo IV taglia solo il DNA metilato / idrossimetilato / glucosil-idrossimetilato, in contrasto con i tipi I-III, che sono inibiti dai modelli di metilazione.
• Il tipo V (ad esempio il complesso gRNA cas9 dei CRISPR) utilizza gli RNA guida (gRNA) per mirare a specifiche sequenze non palindromiche su organismi invasori. È possibile tagliare DNA di lunghezze variabili se viene fornito un RNA guida adatto. A causa della loro flessibilità e facilità d'uso, gli enzimi di restrizione di tipo V sono candidati promettenti per future applicazioni di ingegneria genetica. Vedi anche sgRNA .

Il tipo II ha il tipo IIS e il tipo IIG come sottotipi noti, che tagliano al di fuori della sequenza di riconoscimento.

Nel linguaggio comune, il termine enzima di restrizione è solitamente equiparato a endonucleasi di restrizione di tipo II, poiché gli enzimi di tipo I e III hanno poca importanza nella biologia molecolare. I nomi degli enzimi di restrizione indicano la loro origine. La prima lettera sta per il genere , la seconda e la terza per la specie , è estesa da aggiunte di nomi e l'ordine cronologico della scoperta. Ad esempio, l' enzima EcoRI è il primo enzima trovato nel ceppo Escherichia coli R (ruvido) e SmaI è il primo enzima di Serratia marcescens . Gli enzimi di restrizione di diversa origine con sequenze di riconoscimento identiche e lo stesso schema di taglio sono chiamati isoschizomeri . Se tagliano nella stessa sequenza ma lasciano estremità tagliate diverse, sono chiamati neoschizomeri .

Le sequenze di riconoscimento delle endonucleasi di restrizione di tipo II consistono solitamente in sequenze palindromiche di quattro, sei o otto paia di basi. Il taglio può essere diritto ( estremità smussate, estremità smussate tedesche o estremità lisce, ad esempio SmaI). Tali estremità smussate determinano una minore resa di legatura nel corso della clonazione . La sequenza di riconoscimento di SmaI è: 5'-CCCGGG-3 ' . Il taglio si effettua tra la C e la G :

Il taglio può anche essere sfalsato ( estremità adesive inglesi , estremità adesive tedesche , ad esempio EcoRI ). La sequenza di riconoscimento di EcoRI è: 5'-GAATTC-3 ' . Il taglio si effettua tra la G e la A :  

Le estremità appiccicose sono più facili da legare perché possono ibridarsi tra loro e quindi unirsi più spesso.

Esempi

5'-GAATTC-3'
3'-CTTAAG-5'

5'-G     AATTC-3'
3'-CTTAA     G-5'

5'-GATATC-3'
3'-CTATAG-5'

5'-GAT     ATC-3'
3'-CTA     TAG-5'

5'GGATCC
3'CCTAGG

5'---G     GATCC---3'
3'---CCTAG     G---5'

5'AAGCTT
3'TTCGAA

5'---A     AGCTT---3'
3'---TTCGA     A---5'

5'GGCC
3'CCGG

5'---GG  CC---3'
3'---CC  GG---5'

5'-CATATG-3'
3'-GTATAC-5'

5'-CA     TATG-3'
3'-GTAT     AC-5'

5'-GAGCTC-3'
3'-CTCGAG-5'

5'-GAGCT     C-3'
3'-C     TCGAG-5'

5'-CCCGGG-3'
3'-GGGCCC-5'

5'-CCC     GGG-3'
3'-GGG     CCC-5'

5'-CGATCG-3'
3'-GCTAGC-5'

5'-CGAT     CG-3'
3'-GC     TAGC-5'

5'GAGCTC
3'CTCGAG

5'---GAGCT  C---3'
3'---C  TCGAG---5'

5'GTCGAC
3'CAGCTG

5'---G  TCGAC---3'
3'---CAGCT  G---5'

5'AGTACT
3'TCATGA

5'---AGT  ACT---3'
3'---TCA  TGA---5'

5'-GCATGC-3'
3'-CGTACG-5'

5'-GCATG     C-3'
3'-C     GTACG-5'

5'-TCTAGA-3'
3'-AGATCT-5'

5'-T     CTAGA-3'
3'-AGATC     T-5'

storia

Lo sviluppo della biologia molecolare è iniziato con la scoperta degli enzimi di restrizione nel 1967/68 attraverso l'isolamento dai batteri . Consentono la produzione mirata di frammenti di DNA (frammenti di restrizione), che possono poi essere isolati e, dal 1972, assemblati a nuove costruzioni con l'ausilio di ligasi. Gli enzimi che creano estremità appiccicose sono particolarmente utili perché le estremità sovrapposte sono facili da unire. Il primo articolo di un gruppo di ricerca della Stanford University School of Medicine è apparso nel 1973 negli Atti della National Academy of Sciences . Per il loro lavoro pionieristico sulla "scoperta degli enzimi di restrizione e la loro applicazione nella genetica molecolare" hanno ottenuto Werner Arber , Daniel Nathans e Hamilton O. Smith nel 1978 il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina .

Il nome enzima di restrizione deriva dal sistema di modifica della restrizione batterica utilizzato per difendersi dal DNA estraneo (virale). Molti batteri hanno endonucleasi di restrizione specifiche del ceppo. Le sequenze di riconoscimento corrispondenti nel proprio DNA vengono modificate ( metilate ) e quindi non vengono tagliate. Quando i virus che si moltiplicano nei batteri ( batteriofagi ) iniettano il loro DNA nelle cellule, il DNA non viene metilato e viene scomposto. Solo i virus che provengono da batteri dello stesso ceppo hanno il modello di metilazione corretto e possono continuare a moltiplicarsi. La replicazione dei virus è limitata o ristretta a questo ceppo. (Restriction = restrizione).

Prove individuali

1. ↑ Applied Microbial Systematics, FG Priest, Michael Goodfellow, ISBN 0-7923-6518-6 , anteprima limitata nella ricerca di libri di Google
2. ↑ Cornel Mülhardt: The Experimentator: Molecular Biology / Genomics , Springer 2008, ISBN 3-8274-2036-9 , pagina 48 ( anteprima su Google Libri ).
3. ↑ Roberts, RJ et al. (2003): Una nomenclatura per enzimi di restrizione, DNA metiltransferasi, endonucleasi homing e loro geni. (PDF; 93 kB) In: Nucleic Acids Res. Vol.31, pp. 1805-1812. PMID 12654995
4. ↑ Cornel Mülhardt: Allgemeine Mikrobiologie , Georg Fuchs, Hans G. Schlegel, Georg Thieme Verlag, 2006, ISBN 3-13-444608-1 , pagina 468, anteprima limitata nella ricerca di libri di Google.
5. ↑ Cornel Mülhardt: The Experimentator: Molecular Biology / Genomics , Springer 2008, ISBN 3-8274-2036-9 , pagina 48 ( anteprima su Google Libri ).
6. ↑ R. Barrangou, C. Fremaux, H. Deveau, M. Richards, P. Boyaval, S. Moineau, D. A. Romero, P. Horvath: CRISPR Fornisce resistenza acquisita contro i virus nei procarioti . In: Science . 315, n. 5819, marzo 2007, pp. 1709-1712. codice bib : 2007Sci ... 315.1709B . doi : 10.1126 / science.1138140 . PMID 17379808 .
7. ↑ P. Horvath, R. Barrangou: CRISPR / Cas, il sistema immunitario di batteri e archaea . In: Science . 327, n. 5962, gennaio 2010, pp. 167-170. codice bib : 2010Sci ... 327..167H . doi : 10.1126 / science.1179555 . PMID 20056882 .
8. ↑ Enzimi di restrizione - Strumenti di biologia molecolare. In: New England Biolabs GmbH. URL consultato il 27 febbraio 2020 . 
9. ↑ R. J. Roberts: Enzimi di restrizione e modifica e loro sequenze di riconoscimento . In: Ricerca sugli acidi nucleici . 8, n. 1, gennaio 1980, pagg. R63-r80. doi : 10.1093 / nar / 8.1.197-d . PMID 6243774 . PMC 327257 (testo completo gratuito).
10. ↑ Harvey F. Lodish: Molecular Cell Biology , 5a edizione, WH Freeman and Company, New York 2004, ISBN 0-7167-4366-3 .
11. ↑ Hans-Peter Kröner: Genetica umana. In: Werner E. Gerabek , Bernhard D. Haage, Gundolf Keil , Wolfgang Wegner (a cura di): Enzyklopädie Medizingeschichte . De Gruyter, Berlino 2005, ISBN 3-11-015714-4 , pp. 635-641, qui: p. 640 ( genetica umana nell'epoca biologica molecolare ).
12. ↑ informazioni provenienti della Fondazione Nobel sulla cerimonia di premiazione nel 1978 a Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton O. Smith (in inglese)

link internet

• REBASE : il database più completo di tutti gli enzimi di restrizione conosciuti, inclusa la disponibilità di tutti i produttori commerciali
• NEBCutter - programma basato sul web per tagliare il DNA con tutti gli enzimi di restrizione disponibili; osserva le sensibilità alla metilazione; Simulazione di gel
• WatCut - Programma basato sul web per il taglio del DNA con enzimi di restrizione